Оптимизация генов биолюминесцентной системы грибов позволила значительно улучшить её использование в ряде гетерологичных систем, благодаря работе международного коллектива во главе с сотрудниками Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, опубликованной в Nature Methods.

Исследование, проведенное учёными ИБХ РАН совместно с коллегами из биотехнологических компаний Планта, Promega (США) и Light Bio (США), привело к значительному улучшению работы биолюминесцентной системы грибов в различных эукариотических организмах. Группа из 26 учёных, под руководством Ильи Ямпольского, Карена Саркисяна и Александра Мишина, с ключевым вкладом Екатерины Шаховой, Татьяны Каратаевой, Надежды Маркиной, Татьяны Митюшкиной, Ксении Палкиной и Максима Перфилова, опубликовала статью в журнале Nature Methods. Были подобраны оптимальные аллельные варианты генов светящихся грибов, что позволило создать более яркие биолюминесцентные системы в дрожжах, нескольких видах растений и клетках животных, при этом получив почти 100-кратное увеличение люминесцентного сигнала для некоторых видов растений.

Биолюминесцентная система грибов (FBP1) демонстрировала недостаточную эффективность в гетерологичных хозяевах, даже при использовании сильных промоторов. Например, низкая ферментативная активность и ограниченная стабильность ферментов при физиологически значимых температурах стали причиной крайне слабого сигнала в клетках млекопитающих. Поэтому исследователи стремились улучшить ферменты грибов для достижения яркой, стабильной биолюминесценции для разных гетерологичных систем.

В рамках исследования учёные применили направленную эволюцию к ферментам гриба Neonothopanus nambi: люциферазе (nnLuz) и гиспидин-3-гидроксилазе (nnH3H). В результате были выявлены множество замен, приводящих к увеличению яркости люминесценции в различных организмах. Кроме того, был проведён скрининг ортологичных генов из других видов биолюминесцентных грибов, в результате которого был обнаружен и успешно использован фермент гиспидинсинтазы из Mycena citricolor (mcitHispS), превосходящий в эффективности аналог из Neonothopanus nambi (nnHispS). Следует отметить, что в ходе исследования также была описана важность использования фосфопантетеинилтрансферазы NpgA из Aspergillus nidulans. Использование NpgA в генетических конструкциях значительно увеличивало активность HispS и, как следствие, уровень люминесцентного сигнала.

Для оценки совместной работы улучшенных ферментов были созданы две генетические конструкции: FBP2 (nnHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH и NpgA) и FBP3 (mcitHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH и NpgA). Обе конструкции продемонстрировали значительно более яркую биолюминесценцию по сравнению с контрольной версией (FBP1) в клеточных культурах дрожжей, растений и клетках млекопитающих.

Чтобы оценить, могут ли FBP2 и FBP3 расширить применимость автономной люминесценции для растительной биологии, были созданы трансгенные линии шести видов растений, которые используются как в научных, так и промышленных целях: модельные растения Arabidopsis thaliana и Nicotiana benthamiana, быстрорастущее древесное растение Populus canadensis, декоративные растения Petunia hybrida и Chrysanthemum morifolium, а также культурный табак — Nicotiana tabacum. В отличие от контроля все экспрессирующие FBP2/FBP3 растения были светящимися, а цветущая петуния продемонстрировала яркую биолюминесценцию, видимую в темноте невооруженным глазом. Ни один из улучшенных версий ферментов биолюминесцентного пути не привёл к заметным нежелательным фенотипическим изменениям у растений.

Кроме того, была оценена возможность использования FBP2 и FBP3 для методов оптического анализа, без использования профессионального оборудования. Учёные показали, что используя биолюминесцентные петунию и табак на основе FBP2/FBP3 можно проводить эксперименты с помощью бытовой фотокамеры или даже современных смартфонов.

Исследователи также сравнили работу FBP3 с разными аналогами: оптимизированным бактериальным автолюминесцентным путем iLux, и широко используемыми люциферазами, требующими экзогенного добавления субстрата — люциферазой светлячка и люциферазой NanoLuc. В клеточных культурах растений с FBP3 биолюминесценция была на два-пять порядков ярче по сравнению с iLux, превосходила сигнал от люциферазы светлячка более чем на один порядок, при этом имела уровень люминесценции, сравнимый с NanoLuc. В клетках млекопитающих биолюминесценция FBP3 была примерно в пять раз тусклее, чем у iLux и на два–три порядка ниже по сравнению с люциферазой светлячка и NanoLuc.

В целом полученные результаты подчёркивают значительный прогресс в области генетически кодируемой биолюминесценции и открывают новые возможности для неинвазивного мониторинга физиологических процессов в растениях и животных на протяжении их жизни.

Источник: ИБХ РАН.