Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН
определили, что с помощью белка GEM-GECO можно оценивать концентрацию кальция в
клетках дрожжей. Этот белок был ранее искусственно создан для наблюдения за
концентрацией кальция в нейронах. Он является флуоресцентным, то есть при
облучении светом определенной длины волны может светиться более длинноволновым
свечением. В данном случае, если белок связан с кальцием он излучает синий
свет, а в свободном состоянии – зеленый. При использовании этого белка для
наблюдения за концентрацией кальция в клетках дрожжей было обнаружено, что он
не является нейтральным для клеток, поскольку усиливает физиологические эффекты
повышения концентрации кальция в цитозоле. Однако это не является препятствием
для использования такого подхода для отслеживания уровня кальция в клетках в
режиме реального времени при ответе клеток на внешние раздражители. Результаты
исследования, опубликованы в International Journal of Molecular
Sciences. Исследование проводилось при поддержке национального проекта «Наука и
университеты».
В клетках растений, животных и грибов, в том числе
дрожжей, ионы кальция выступают в качестве посредника, позволяющего реагировать
на разные внешние раздражители. Поэтому в «спокойном состоянии» количество этих
ионов в цитозоле должно поддерживаться на постоянном низком уровне. Если же он
повышается, ионы перекачиваются из цитозоля в так называемое депо, которым у дрожжей
служит вакуоль. В норме кальций накачивается туда с помощью специального
белка-насоса PMC1, встроенного в мембрану вакуоли. У мутантов, лишенных этого
транспортера, при определенных условиях ионы могут неконтролируемо
накапливаться в цитозоле, что приводит к остановке деления клеток или их
гибели.
Ученые из ФИЦ Биотехнологии РАН (Москва) предложили
новый подход для отслеживания уровня кальция в клетках дрожжей. Для этого
авторы использовали белок GEM-GECO, ген которого методами генной инженерии
искусственно встроили в ДНК дрожжей. GEM-GECO имеет два важных свойства:
во-первых, он светится в определенном диапазоне, благодаря чему за ним легко
наблюдать, и, во-вторых, он способен связываться с ионами кальция в цитозоле –
жидком содержимом клетки. При этом образуются комплексы, которые тоже испускают
свечение, но с другой длиной волны. Соответственно, по характеру излучения
можно оценить концентрацию цитозольного кальция.
Также авторы показали, что мутантные клетки дрожжей,
у которых отсутствует транспортер PMC1, закачивающий кальций в депо, растут
гораздо хуже обычных, особенно если в них синтезируется белок GEM-GECO. Это
вызвано губительным действием ионов кальция, в большом количестве остающихся в
цитозоле.
Кроме того, оказалось, что у мутантов, лишенных
транспортера PMC1, заметно увеличивается удельная продукция белка GEM-GECO.
На основе экспериментов авторы заключили, что
GEM-GECO можно использовать для оценки уровня кальция в дрожжевых клетках,
поскольку его переход из связанного с кальцием состояния в свободное происходит
в том диапазоне концентраций кальция, который является естественным для
цитозоля дрожжевых клеток при переходе из нормального состояния в режим
реагирования на внешние раздражители.
Источник: ФИЦ Биотехнологии РАН.