Ученые из МГУ, Сколтеха и ИТЭБ РАН изучили механизм
действия одного из ферментов, который разрезает ДНК, и предложили механизм, позволяющий
контролировать его активность. Их разработки весьма перспективны для технологии
редактирования генома. Результаты этого исследования были опубликованы в конце
2018 года в журнале PLoS ONE.
Редактирование генома является одним из наиболее многообещающих
направлений биотехнологии и молекулярной медицины будущего. Манипуляции
с ДНК ученые осуществляют с помощью бактериальных ферментов. Эти ферменты
узнают в последовательности ДНК определенный участок и в этом месте с
хирургической точностью разрезают ДНК. В месте
гидролиза может быть проведено включение, удаление или перемещение фрагментов
ДНК. После внесения разрыва в ДНК клетка не погибает за счет естественной
защитной системы - процесса репарации.
При этом происходит исправление дефектного места за счет здоровой копии из
парной хромосомы или же, в случае, если «правильной» копии гена нет, его можно
внести в клетку вместе с ферментом-«редактором». Тогда для репарации
поврежденной ДНК используется именно эта последовательность. Одна из самых
востребованных технологий редактирования генома на сегодняшний момент - CRISPR/Cas.
Однако у этого метода есть существенный недостаток – при использовании
CRISPR/Cas возникает множество незапланированных и непредсказуемых мутаций.
Одной из причин этих мутаций является то, что геномный
редактор этой системы, белок Cas9 разрезает обе цепи в спирали ДНК, после чего
запускается процесс негомологичной рекомбинации, при которой фрагменты ДНК
могут перестраиваться случайным образом. Эти мутации не обязательно сразу
приводят к каким-либо серьезным последствиям для клетки и организма, но чего
ожидать от них впоследствии - не известно.
Для повышения точности
редактирования генома в качестве потенциальных терапевтических агентов
тестируются другие ферменты. Одними из них являются сайт-специфические никующие
эндонуклеазы – ферменты, узнающие в ДНК короткую специфическую
последовательность, но вносящие разрыв в строго определенном месте только в
одну из цепей ДНК. При репарации одноцепочечных разрывов инициируется
гомологичная рекомбинация, значительно уменьшающая количество возможных ошибок
в ДНК.
Исследователи из Института
теоретической и экспериментальной биофизики РАН под руководством проф.
Л.А.Железной изучают эти ферменты на протяжении двух последних
десятилетий и являются одними из их первооткрывателей.
Их коллеги из МГУ (химический факультет, НИИ физико-химической биологии имени
А.Н. Белозерского) сконструировали модифицированные олигонуклеотиды с остатками
азобензола и триэтиленгликоля, с помощью которых можно регулировать активность
никующих эндонуклеаз.
Эта работа направлена на предотвращение появления
неконтролируемых разрывов в ДНК. Химики создали модифицированный ДНК-дуплекс
(короткий двухцепочечный фрагмент ДНК) с остатком триэтиленгликоля внутри цепи,
содержащий участок, с которым никующая эндонуклеаза связывается, но не может
его разрезать. Такой дуплекс блокирует активность фермента. Однако
двухцепочечная структура дуплекса стабильна только при комнатной температуре.
При нагревании до 45°С цепи ДНК расходятся, и никующая эндонуклеаза
высвобождается из комплекса с негидролизуемым аналогом субстрата. Свободный
фермент снова способен выполнять свою работу: он специфически разрезает
модельную ДНК.
«Наши эксперименты подтвердили доказательство концепции
подхода «обратимой молекулярной ловушки» в регуляции активности никующих
эндонуклеаз модифицированными олигонуклеотидами», - рассказывает первый автор
статьи, кандидат химических наук, научный
сотрудник Химического факультета МГУ Людмила Абросимова. «Температура переключения
ингибитора ДНК-дуплекса может быть легко настроена путем изменения длины
олигонуклеотида, поэтому наша система может быть адаптирована для различных
применений».
Авторы работы полагают, что предложенный ими подход будет
способствовать разработке новых методов биоанализа и амплификации ДНК с
вытеснением цепи, основанных на применении сайт-специфических никующих
эндонуклеаз, а также расширит границы применения этих ферментов в
редактировании генома.
Работа выполнялась при поддержке грантов РНФ (№ 14-24-00061) и РФФИ (№ 17-54-45126).
Источник:
Liudmila A. Abrosimova, Anzhela Yu. Migur, Elena A. Kubareva,Timofei S. Zatsepin, Aleksandra V. Gavshina, Alfiya K. Yunusova,Tatiana A. Perevyazova, Alfred Pingoud †, Tatiana S. Oretskaya. A study on endonuclease BspD6I
and its stimulus-responsive switching by modified oligonucleotides. PLoS ONE (2018) 13(11): e0207302.
https://journals.plos.org/plosone/article?id=10.1371/journal.pone.0207302
Релиз подготовила
Татьяна Перевязова,
Пресс-служба ИТЭБ РАН