Версия для печати

В Институте цитологии РАН придумали метод, позволяющий оценить способность клетки противостоять окислительному стрессу

Исследователи Института цитологии РАН (ИНЦ РАН) разработали способ количественной оценки внутриклеточного уровня перекиси водорода, повышающегося в условиях окислительного стресса, индуцированного внешними и внутренними источниками. Новый метод позволяет оценить эффективность антиоксидантной защиты в различных типах клеток и в дальнейшем может использоваться для диагностики и поиска путей коррекции заболеваний, вызванных или сопровождающихся повышением окислительных нагрузок на клетки. Результаты исследования опубликованы в научном журнале Redox Biology.

Кислород является необходимым условием для поддержания жизни человека и многих других организмов. Однако активные кислород-содержащие соединения, например, перекись (Н2О2), могут повреждать живые клетки. Превышение уровня Н2О2 над физиологически комфортным порогом называется окислительным стрессом, он может вызывать или усугублять многие тяжелые заболевания, такие как атеросклероз, инфекционные заболевания, нейродегенерации, диабет. Кроме того, окислительный стресс развивается под действием радиации и является важной составляющей её негативного влияния на организм человека.

Изучение процессов, в которых участвуют Н2О2 в клетках, ранее было затруднено отсутствием надежных методов её определения, ведь время жизни этих высоко-активных молекул и их содержание в клетке крайне малы. В 2006 году ученые Института биоорганической химии РАН разработали генетически кодируемый биосенсор HyPer, который способен детектировать молекулы Н2О2 благодаря способности изменять свои флуоресцентные свойства при окислении перекисью. Генетические технологии позволяют вводить ген биосенсора в клеточный геном, после чего с помощью лазера можно детектировать флуоресцентный сигнал HyPer и отслеживать внутриклеточный уровень Н2О2 в живых клетках. Чем ярче свечение - тем больше молекул Н2О2 находится в клетке.

«Мы предложили использовать данный сенсор не только как средство визуализации перекиси водорода в живых клетках, но и как точный аналитический инструмент. С помощью нашего метода можно сказать, сколько молекул Н2О2 содержится в клетках в данный момент. Ранее в своих работах мы доказали принципиальную возможность проведения подобных измерений. В текущем исследовании наш подход был усовершенствован и использован для оценки активности системы антиоксидантной защиты в клетках человека разных фенотипов при различных окислительных нагрузках», - рассказывает руководитель лаборатории внутриклеточной сигнализации ИНЦ РАН Ольга Люблинская.

В исследовании были использованы несколько линий нормальных клеток человека и две клеточных линии опухолей, в которые вводили ген биосенсора HyPer и подвергали воздействию перекиси водорода в различных концентрациях.

Ответ клеток на окислительный стресс, вызванный Н2О2, оценивался с помощью проточного цитометра – прибора, который при помощи световых откликов клеток позволяет наблюдать за окислением молекул биосенсора в каждой конкретной клетке. С помощью данного оборудования в режиме реального времени отслеживалась кинетика окисления сенсора при индукции стресса. Последующая математическая обработка экспериментальных данных позволила исследователям определить установившуюся в условиях стресса внутриклеточную концентрацию перекиси и градиент Н2О2 (разница между количеством перекиси внутри и снаружи клетки) - этот показатель позволяет оценить уровень антиоксидантной защиты клеток, их способность справляться с избыточным количеством Н2О2.

«Благодаря нашему подходу мы обнаружили, что в опухолевых клетках защита от Н2О2 значительно менее эффективна, чем в нормальных клетках, а в плюрипотентных стволовых клетках человека наоборот - эта система наиболее активна. И мы предполагаем, что метод, разработанный в этом исследовании, может быть применен для дальнейшего углубленного изучения активности окислительно-восстановительных систем в клетках человека. Очень важно правильно понимать, как работают эти внутриклеточные молекулярные машины. Ведь повышенный уровень окислителей, возникающий в организме из-за сбоев этих систем, может быть эффектом, сопровождающим или осложняющим различные патологии, например, аллергические реакции или аутоиммунные заболевания», - поясняет Ольга Люблинская.

В научный коллектив вошли специалисты из ИНЦ РАН, а также студенты Санкт-Петербургского государственного университета и Санкт-Петербургского политехнического университета Петра Великого. Исследования поддержаны грантом Российского научного фонда и проводились на базе существующей научной инфраструктуры мирового уровня - использовалось оборудование объекта инфраструктуры “Центр клеточных технологий ИНЦ РАН”. Часть клеточных линий для экспериментов были предоставлены центром коллективного пользования «Коллекция культур клеток позвоночных», расположенным в ИНЦ РАН.