Международная группа ученых, в которую входит представитель ФИЦ биотехнологии РАН, ИОГЕН и МФТИ, разработала новый, более надежный метод для изучения контактов РНК с ДНК в ядре клеток. Метод поможет определить роль РНК в регуляции работы генов, что в будущем может быть важно, например, для лечения различных заболеваний Статья об исследовании опубликована в Nature Communication. Работа была поддержана Российским научным фондом (РНФ).

РНК и активность генов

Ранее считалось, что РНК — это лишь промежуточная стадия между ДНК и белком (рисунок 1а). Но когда научный мир начал описывать работу генома, оказалось, что далеко не все участки ДНК кодируют РНК. Более того, даже те, с которых считывается РНК, не обязательно кодируют белки. Функция большинства некодирующих РНК до сих пор неочевидна. В разных типах клеток должны работать разные гены и синтезироваться разные белки: в клетке мозга — одни, в клетке крови — другие. Это значит, что существуют факторы, которые влияют на активность генов. Теперь ученые начали понимать, что некодирующие РНК также являются одним из этих факторов.

Известно, что длинные некодирующие РНК взаимодействуют с хроматином — веществом, которое представляет собой молекулу ДНК, плотно упакованную с помощью белков (рисунок 1б). Хроматин может менять свою структуру: разворачиваться и сворачиваться, открывая гены для считывания или, наоборот, закрывая их. Если некодирующие РНК связываются с определенными участками хроматина, они могут влиять на его структуру и таким образом регулировать активность этих участков. Чтобы понимать, как регулируется активность генов и как это влияет на специализацию клетки, необходимо знать, какие некодирующие РНК с какими участками связываются.

Как это работает

Есть несколько методов, которые позволяют определять места, где взаимодействуют РНК и хроматин. Однако из-за ряда ограничений они пропускают много взаимодействий, к тому же некоторые из них требуют для анализа большого количества материала или разрушения клетки. Авторы работы разработали новый метод, который не разрушает клетку до закрепления контактов РНК и хроматина и показывает более высокую точность, — они назвали его RADICL-seq.

В ядре клетки большинство РНК связаны с хроматином: РНК закрепляется в белках, которые связывают ДНК. Метод RADICL-seq заключается в следующем. В ядро добавляется фермент, который делает разрывы на ДНК и оставляет свободные концы, пригодные к сшивке. Также добавляется фермент, который разрушает свободные РНК и тем самым повышает точность определения контактов. Потом добавляют молекулу, у которой один конец — одноцепочечный и связывается с РНК, а второй — двухцепочечный и связывается с расположенной рядом ДНК (рисунок 2а). Таким образом, эта молекула служит мостиком, скрепляющим РНК и ДНК. Дальше удаляют белки, достраивают вторую цепочку и получившийся ДНК-комплекс готовят к секвенированию (рисунок 2b), где определяют последовательности связанных РНК и ДНК.

Раскодировать некодирующее

Ученые проверили метод RADICL-seq в действии. По сравнению с другими методами, он показал более высокую точность определения хроматин-РНК-взаимодействий. 
Благодаря высокому разрешению метода авторам удалось найти новые контакты не только некодирующих, но и кодирующих РНК с хроматином, включая те, которые расположены вдали от мест, где данная РНК считывается. Также они показали на клетках мыши, что метод подходит для изучения специфики взаимодействий в разных типах клеток. Они взяли две некодирующие РНК (одна из них, возможно, связана с шизофренией) и построили карту их взаимодействий с геномом в двух типах клеток: эмбриональных стволовых и предшественников олигодендроцитов (нейроглиальных клеток). Карты получились характерными для данных типов клеток и РНК (рисунок 3).

Исследование подтвердило важную роль длинных некодирующих РНК в регуляции участков генома, удаленных от мест считывания этих РНК. Гибкость метода RADICL-seq позволяет получить дополнительную биологическую информацию при внесении изменений в эксперимент. В частности, дает возможность обнаружить взаимодействия РНК-ДНК, не опосредованные белками хроматина. Наличие таких контактов указывает на роль в регуляции экспрессии генов не только канонических взаимодействий (таких как РНК-ДНК двойные спирали), но и неканонических (триплексов РНК-ДНК-), а также на значение некодирующих РНК в нацеливании белковых комплексов в конкретные места генома.

«Мы планируем дальше исследовать, как РНК участвует в регуляции экспрессии генов, архитектуры хроматина и, в конечном счете, на идентичность клеток. Вполне возможно, что в будущем с помощью этих некодирующих РНК можно будет контролировать активность конкретных генов, что важно, например, для лечения различных заболеваний», — прокомментировала Юлия Медведева, заведующая группой регуляторной транскриптомики и эпигеномики ФИЦ биотехнологии РАН и заведующая лабораторией биоинформатики клеточных технологий МФТИ, руководитель проекта по гранту РНФ.

 

Рисунок 1. а) Реализация генов: с ДНК считывается РНК, а с РНК — белок.
               б) В ядре клетки молекула ДНК упакована с помощью специальных белков в хроматин, из которого и состоит хромосома.
Источники: Таблица генетического кода; Wiring Diagram Database, Diagram Of Chromatin

Рисунок 2. а) Реакции, производимые в ядре клетки. Красным показана РНК, черным — ДНК, голубым — белки, синим — связующая молекула. Черная точка — молекула, позволяющая «выцепить» комплекс из раствора. Пояснения даны в тексте.
                b) Реакции, производимые в растворе: 1) удаляются белки, 2) достраивается вторая цепь, 3) обрезается до определяемого размера, 4) присоединяются последовательности для распознавания и 5) производится секвенирование.
Источник: Nature Communication

Рисунок 3. Диаграммы, изображающие взаимодействия некодирующих РНК: Neat1 (a, b) и Fgfr2 (c, d) в эмбриональных стволовых клетках мыши (mESC) и клетках-предшественниках олигодендроцитов (mOPC). Neat1 синтезируется с 19-й хромосомы, а Fgfr2 — c 7-й.
Источник: Nature Communication