Версия для печати
Вернуться к списку

Вирус в «сетях доброй надежды»

Группе ученых в составе проекта The Good Hope Net благодаря использованию вычислительных ресурсов МСЦ РАН удалось получить перспективные аптамеры-кандидаты для создания будущих препаратов для терапии и диагностики COVID-19

Антикоронавирусный проект The Good Hope Net, «Сеть доброй надежды», выходит на новый этап. Этот международный некоммерческий проект, который поддерживает национальный чемпион ГК РСК, нацелен на разработку лекарств, а также на улучшение средств диагностики для борьбы с COVID-19. The Good Hope Net объединяет уже 21 научно-исследовательскую организацию из восьми стран: России, Финляндии, Италии, Китая, Тайваня, Японии, США и Канады (во время запуска в его работе участвовало 12 организаций из шести стран). Проект стартовал в марте 2020 года и сразу получил приоритетный доступ к вычислительным ресурсам Межведомственного суперкомпьютерного центра (МСЦ) РАН. Суммарная пиковая производительность вычислительных систем МСЦ РАН, которые разработали и установили специалисты ГК РСК на базе своих высокоплотных и энергоэффективных решений «РСК Торнадо» и RSC PetaStream со 100% жидкостным охлаждением горячей водой, составляет уже 1,8 Пфлопс (петафлопс — квадриллион операций с плавающей запятой в секунду, или 1000 терафлопс).

КАК УСЛОЖНИТЬ ЖИЗНЬ КОРОНАВИРУСУ

Во внешней среде вирусы никак себя не проявляют и активизируются, только попадая внутрь организма-хозяина. Там они проникают в клетки и начинают использовать внутренние ресурсы организма-хозяина для размножения. Для того чтобы эффективно связываться с клетками и проникать в них, вирусы имеют множество различных адаптаций. Одна из таких адаптаций — специализация вирусов: большинство из них очень избирательны и связываются только с клетками определенных тканей небольшого количества биологических видов.

Своих жертв вирусы узнают по особым молекулам на поверхности клеток, которые можно назвать клеточными «отпечатками пальцев». У вирусов же есть специальные белки, которые распознают эти молекулы и обеспечивают связывание с поверхностью клетки. Эти белки достаточно специфичны и обычно гораздо хуже связываются с другими молекулами. У коронавируса SARS-CoV-2 такой белок называется спайк-белком (Spike-protein), который селективно связывается с человеческим белком ACE2.

Одним из направлений разработки противовирусных препаратов является блокирование вирусных белков, отвечающих за распознавание клеток. В этом случае вирусу будет намного труднее связаться с клеткой-мишенью и заболевание будет протекать значительно легче.

Как же это можно сделать? К примеру, подобрать специфичные антитела, которые прочно связывались бы с конкретным вирусным белком. Однако разработка антител — процесс довольно трудоемкий и сложный. Сравнительно недавно был открыт другой подход, использующий для подобных задач короткие последовательности нуклеиновых кислот (ДНК или РНК), которые называются аптамерами. В отличие от антител подбор аптамеров можно в существенной мере автоматизировать с помощью процедуры «молекулярной эволюции», называемой SELEX. Эта методика позволяет за сравнительно короткое время подобрать высокоспецифичные аптамеры для выбранной молекулы-мишени, например вирусного белка.

Аптамеры - это олигонуклеотиды, которые используются для специфического связывания с определёнными молекулами-мишенями (от лат. aptus – подходящий, прилаженный),

БИБЛИОТЕКА ИЗ 256 АПТАМЕРОВ

Участники проекта The Good Hope Net при помощи суперкомпьютерного моделирования разрабатывают аптамеры для связывания со спайк-белком коронавируса SARS-CoV-2. Исследователям не требуется нарабатывать большое количество вирусных белков, достаточно иметь их трехмерную модель. Это позволяет начать разработку потенциальных лекарств на самых ранних этапах эпидемии. Однако для подобных исследований нужны мощные вычислительные ресурсы. Теоретическое моделирование лекарств на основе таких крупных соединений, как аптамеры, стало доступным сравнительно недавно, с развитием суперкомпьютерных технологий, и методики еще только разрабатываются. Тем не менее группе ученых — участников проекта The Good Hope Net благодаря использованию вычислительных ресурсов МСЦ РАН удалось получить перспективные аптамеры-кандидаты для создания будущих препаратов для терапии и диагностики коронавирусной инфекции COVID-19.

В ходе проекта уже сконструирована библиотека из 256 олигонуклеотидов с рандомизированным участком из четырех нуклеотидов и дуплексной частью. Из этого стартового набора выбран один наиболее перспективный кандидат — аптамер, связывающийся с рецептор-связывающим доменом спайк-белка коронавируса. Олигонуклеотиды — это короткие фрагменты ДНК или РНК, как правило 20‒100 нуклеотидов. Аптамеры — это олигонуклеотиды, которые используются для специфического связывания с определенными молекулами-мишенями (от лат. aptus — подходящий, прилаженный), например с белками.

«В нашем исследовании стартовый набор создавали in silico, то есть с помощью компьютерного моделирования. Были смоделированы аптамеры в форме “шпильки”, ножка которой состояла из комплементарных пар нуклеотидов, и была дуплексная часть, одинаковая для всех аптамеров в библиотеке. Головка шпильки включала в себя четыре нуклеотида, на место которых мы подставляли аденин, цитозин, гуанин и тимин во всех возможных комбинациях — рандомизированный участок. Подстановка четырех видов нуклеотидов на четыре позиции дала 256 разных комбинаций, то есть библиотеку из 256 разных аптамеров», — пояснила «Стимулу» координатор проекта Анна Кичкайло, заведующая лабораторией цифровых управляемых лекарств и тераностики ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН», руководитель лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого.

Олигонуклеотид-кандидат усовершенствован в ходе нескольких раундов последовательного направленного мутагенеза с обязательной проверкой места и энергий связывания. Затем Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» синтезировал для дальнейшей работы ученых рекомбинантные спайк-белки, которые нужны для экспериментальной проверки свойств аптамеров, смоделированных на суперкомпьютере.

Как рассказала Анна Кичкайло, ученым удалось несколькими методами экспериментально подтвердить связывание выбранных аптамеров со спайк-белком коронавируса и его рецептор-связывающим доменом: «Наши китайские коллеги доказали факт связывания с помощью проточной цитометрии: посадили спайк-белок на микронные частички, и когда аптамер с флуоресцентной меткой связывался с белком, вся частичка флуоресцировала. Мы использовали метод поляризации и флуоресценции, при котором большой белок при связывании с маленьким флуоресцирующим аптамером уменьшает его степени свободы при свободном вращении в среде, тем самым изменяя поляризацию флуоресценции и анизотропию. Кроме того, мы применили третий метод — малоугловое рентгеновское рассеяние (на станции БИоМУРР в Курчатовском институте) для определения точного места связывания аптамера со спайк-белком. С помощью этого метода установили трехмерную модель аптамера и спайк-белка отдельно, а также их комплекса. Оказалось, что линейные размеры комплекса в одной из проекций как раз соответствуют сумме размеров отдельных молекул, значит, связывание происходит именно в соотношении 1:1».

Эксперимент также показал, что у выбранных аптамеров отсутствует связывание с компонентами плазмы крови человека. Это дает надежду на высокую степень их потенциальной применимости для разработки новых препаратов.

Координатор проекта Анна Кичкайло, заведующая лабораторией цифровых управляемых лекарств и тераностики ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН», руководитель лаборатории биомолекулярных и медицинских технологий Красноярского государственного медицинского университета имени профессора В. Ф. Войно-Ясенецкого

ДЛЯ БОРЬБЫ С ЛЮБЫМИ ВИРУСАМИ

Надо понимать, что аптамер — лишь одна из составляющих терапевтического или диагностического средства. Далее на основе подтвержденных аптамеров начинается процесс конструирования лекарственных препаратов, ведется разработка тест-систем.

«Для того чтобы превратить олигонуклеотид со сродством к определенной мишени в лекарственный препарат, нужно его немного модифицировать, — поясняет Анна Кичкайло, — “пришить” к нему специальную химическую группу, чтобы он не сразу распадался в крови (в крови есть нуклеазы, которые разрушают ненужные организму короткие ДНК). Еще можно “пришить” к нему лекарственный препарат, чтобы адресно доставить его в нужное место для лечения. Для диагностики можно “пришить” к аптамеру метку для визуализации на ПЭТ или МРТ или использовать аптамер в качестве сенсора для in vitro диагностики (например, по крови или слюне)».

Следующим шагом в работе The Good Hope Net станет конструирование терапевтических препаратов на основе полученных олигонуклеотидов, анализ их физико-химических и противовирусных свойств, детальное изучение механизмов действия. Этот комплекс исследований включает в себя как экспериментальные работы на белках, клеточных культурах и животных, так и теоретическое суперкомпьютерное моделирование с использованием еще более сложных, чем на первом этапе, современных вычислительных методов.

По словам Анны Кичкайло, проект важен еще и тем, что разработанную методику можно будет применить для оперативной разработки лекарств против других вирусов: «Нашей идеей стала разработка специальной методики и такого алгоритма, который поможет в течение достаточно короткого времени создать лекарственный препарат на основе ДНК-аптамеров, которые способны специфически связываться с определенными значимыми молекулами не только на коронавирусе, но и на любом другом патогене. То есть результаты этого проекта можно будет использовать для борьбы с любыми другими патогенами. Почему это важно? Потому что в случае возникновения новой инфекции при использовании стандартных молекулярных технологий недостаток биологического материала может привести к удлинению сроков производства новых противовирусных препаратов. А наши разработки в рамках проекта The Good Hope Net позволят решит эту проблему».