Российские ученые создают новые биосенсоры, которые будут измерять
основной показатель качества воды — биохимическое потребление кислорода — в
сотни раз быстрее, чем это происходит сейчас. Инновационной разработкой
занимаются специалисты Тульского государственного университета, Института биохимии
и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина, расположенного в наукограде
Пущино, и МИРЭА — Российского технологического университета
Полный вид лабораторной установки для выполнения биосенсорных измерений
общего плана. Установка собрана в Лаборатории биосенсоров, ИБФМ РАН, Пущино
Уровень чистоты сточных вод, а также устойчивость водоемов к
токсическому воздействию попадающих в них стоков и загрязняющих веществ
определяются по скорости процессов гидролиза и окисления. Эти показатели напрямую
зависят от того, насколько быстро жидкость насыщается кислородом.
Основными параметрами чистоты сточных вод считаются уровни химического
и биохимического потребления кислорода (ХПК и БПК). Если ХПК демонстрирует
количество кислорода, необходимое для окисления всей органики в пробе воды, то
в БПК за основу берется потребление кислорода аэробными видами микроорганизмов.
Есть такое понятие, как легко окисляющаяся органика, которую и съедают эти микроорганизмы.
Поэтому чем больше ее в стоках, тем выше показатель БПК и тем «грязнее» вода,
жидкость.
Равенство уровней химического и биохимического потребления кислорода
говорит о способности природной экосистемы самостоятельно справиться с
органическим загрязнением. Если химическое потребление превышает биохимическое,
то без специальных методов очистки не обойтись. Основная проблема связана с
тем, что для оценки биохимических процессов нужно время: от пяти суток в
условиях лаборатории при стационарных условиях.
Микроорганизмы используются для анализа БПК уже несколько десятилетий,
однако выполнение исследования до сих пор занимает не менее пяти дней. Применение
инновационного биосенсора позволит сократить время измерения в сотни раз.
Исследование, цель которого — создать инновационный вариант биосенсора,
было финансово поддержано Минобрнауки России. Обзорная статья, а также статьи о
непосредственно созданных специалистами анализаторах опубликованы в международных
изданиях. Работа велась на базе молодежной лаборатории биологически активных
соединений и биокомпозитов Тульского государственного университета (ТулГУ),
которая была открыта в 2021 году в рамках деятельности научно-образовательного
центра мирового уровня «ТулаТех». В исследовании принимали участие сотрудники
Пущинского научного центра биологических исследований РАН, а также японский профессор Хидеаки
Накамура — один из авторитетнейших в мире исследователей в области биосенсоров.
Заведующий лабораторией биосенсоров ИБФМ РАН, профессор, доктор химических
наук, заслуженный деятель науки и техники Московской области Анатолий Решетилов
НАУЧИТЬСЯ РАЗГОВАРИВАТЬ С ФЕРМЕНТОМ
Сотрудничество пущинских и тульских ученых началось еще в 2000 году,
когда автор изобретения, заведующий лабораторией биосенсоров Института биохимии
и физиологии микроорганизмов (ИБФМ) РАН, профессор, доктор химических наук, заслуженный
деятель науки и техники Московской области Анатолий Решетилов начал
читать лекции в ТулГУ. В течение восьми лет он рассказывал студентам на кафедре
«Приборы и биотехнические системы», что такое биосенсоры и биосенсорная
технология. Одним из слушателей был Вячеслав Арляпов. Вячеслава эта тема
очень заинтересовала, и он решил продолжить ею заниматься после окончания университета.
Теперь Вячеслав Арляпов — директор научно-исследовательского центра «БиоХимТех»,
который действует при ТулГУ.
Сам Анатолий Решетилов познакомился с биосенсорами в первой половине
1990-х, когда в мире только начинали появляться разработки в этой области.
Биосенсор — это аналитический прибор, который на основе свойств
биологического материала выявляет присутствие определенных соединений в
объектах окружающей среды, в воздухе, водной среде. «К примеру, в градуснике,
который показывает температуру, сенсором является ртуть, и это неорганический
сенсор, — пояснил в беседе со “Стимулом” Анатолий Решетилов. — А если мы
каким-то образом в компоновку термометра вставим биологический материал и будем
следить за его поведением, то мы получим биосенсор. Он будет термическим —
фермент при каталитической реакции вызывает нагревание. Ведь мы по себе знаем,
что чувствуем холод и тепло, то есть на внешнюю среду реагируют какие-то
рецепторы. Мы чувствуем вкус чая, кофе, пирога. И все это из-за того, что в
нашем организме имеются ферменты: один реагирует на глюкозу, второй — на
сахарозу, третий — на этиловый спирт, четвертый — еще на что-то и так далее. А
потом все это собирается и обрабатывается, и этот процесс называется
химико-биологическое распознавание, то есть определение вещества».
Биосенсоры можно конструировать с помощью микроорганизмов, антител,
ферментов. Вся биосенсорика начиналась именно с использования ферментов — стартовали
с определения уровня глюкозы в образцах крови человека. Применяли глюкозооксидазу
— фермент, который окислял глюкозу. Диабет — одна из главных проблем человечества,
миллионы людей страдают из-за того, что у них из-за отсутствия инсулина плохо
перерабатывается глюкоза; для быстрой диагностики диабета и сконструировали
глюкозный биосенсор.
«Раньше, лет тридцать назад, ситуация была такая: идешь в клинику, у
тебя берут пять кубиков крови, ставят на некий прибор, и приходится ждать целый
час, пока не будет готов анализ, — рассказывает Анатолий Решетилов. — А если
использовать биосенсор, то взял капельку крови, один-два микролитра (легкий
укол шприцевой иголки), привел в соприкосновение с ферментом и сразу получил
результат. Для исследователя главный вопрос — научиться правильно
«разговаривать» с ферментом, «понимать» его».
Разнообразие биологического материала в природе крайне велико: и в
человеке, и вокруг него находится огромное количество микроорганизмов. И все
микроорганизмы очень тривиальны в своей реакции на вещества. В качестве примера
можно привести ту же самую глюкозооксидазу.
«В присутствии глюкозы глюкозооксидаза поглощает из среды кислород,
поэтому можно следить за уровнем кислорода вблизи фермента, чтобы обнаружить
присутствие глюкозы, — это один тип сенсора, — рассказывает ученый. —
Глюкозооксидаза при окислении глюкозы нагревает пространство, можно определить
уровень глюкозы по изменению температуры. Еще глюкозооксидаза при
взаимодействии с глюкозой выделяет некоторое побочное вещество, которое мы все
знаем, — это пероксид водорода, перекись. Изучаемую жидкость можно поместить в
кювету спектрофотометра и смотреть за прохождением света, появляется ли там
пероксид водорода. Существует много вариантов биосенсоров для детекции одного и
того же соединения, нужно только понимать свойства биологического материала».
Ведущий научный сотрудник лаборатории биологически активных соединений
и биокомпозитов ТулГУ, руководитель стратегического проекта «БиоХимТех» программы
«Приоритет 2030» Вячеслав Арляпов
ПОЕДАТЕЛИ КИСЛОРОДА
Когда ученые искали пути будущей исследовательской работы, они решили выбрать
что-то простое и подумали: а почему бы не заняться биосенсорами, которые определяют
БПК?
«Свои исследования мы начали с объекта, который можно назвать “стакан
закисающего молока”, — рассказывает Анатолий Решетилов. — Молоко может стоять
хоть сто лет, и никаких изменений не произойдет, если в нем не будет
микроорганизмов. А если оно заражено микроорганизмами, то начинается процесс
брожения. В цельном молоке очень много органики, и брожение будет происходить
быстро. Чем сильнее брожение, тем больше в процессе окисления будет
потребляться кислорода».
А за основу анализатора ученые взяли хорошо известный, простой по
конструкции и недорогой электрод Кларка, который позволяет измерять
концентрацию кислорода в среде. Если поместить на этот электрод мембрану с
бактериальными клетками, которые окисляют какое-то конкретное вещество, к
примеру этиловый спирт, глюкозу, сорбозу и так далее, как раз и получится
биосенсор для измерения/детекции этого вещества. Но это может быть и сумма
веществ — как в случае измерения БПК. Достоинства метода — высокая скорость,
простота, возможность многократного измерения, дешевизна.
«Быстрота измерения — один из
главных плюсов технологии, — отмечает ученый. — Принцип у этого метода такой
же, как и у классического, только сейчас берут емкость со средой, которую надо
изучить, добавляют туда нужный микроорганизм, определяют уровень кислорода,
герметично закрывают и ждут пять суток, после чего снова измеряют уровень
кислорода. Мы же наносим на мембрану пленку с высокой концентрацией микроорганизмов,
а им только подавай окисляемое соединение и кислород. В результате на измерение
затрачивается пять-десять минут, если концентрация БПК низкая, и около двадцати
минут — если концентрация БПК высокая».
Исследователи опубликовали обзорную статью о самых современных
разработках в мире в этом направлении. В ней рассмотрен опыт создания и
практического применения биосенсоров, накопленный мировым сообществом.
«Особое внимание уделили перспективам создания новых практически важных
моделей биосенсоров, которые позволят проводить анализ быстрее и точнее.
Обзорная статья стала одной из первых в мире, где систематизированы и
критически рассмотрены коммерческие модели БПК-биосенсоров, продающиеся в
разных странах мира. Это станет отправной точкой для разработки новых
эффективных моделей в России», — рассказал Вячеслав Арляпов.
ОСТАЛОСЬ МАСШТАБИРОВАТЬ ТЕХНОЛОГИЮ СУШКИ
Аппаратную часть измерителя БПК создают специалисты компании
«Эконикс-Эксперт». Это разработчик и производитель профессиональных решений в
области аналитических измерений, экологического контроля, образования. «Эконикс-Эксперт»
занимает лидирующие позиции среди российских производителей электрохимического
и оптического лабораторного оборудования.
«Наша совместная разработка соответствует мировому уровню, — рассказал
“Стимулу” сотрудник компании, доцент РТУ МИРЭА Павел Мельников. — В мире отчетливо
прослеживается тренд на внедрение экспрессных биосенсорных методик мониторинга
состояния окружающей среды, а в России таких приборов раньше не было. До
недавнего времени они импортировались из европейских стран».
Разрабатываемое устройство — комплект «Эксперт-009-БПК» (экспресс) —
является одной из разновидностей выпускаемого компанией «Эконикс-Эксперт» анализатора
растворенного кислорода «Эксперт-009». Прибор в зависимости от задачи может
комплектоваться разными датчиками (электрохимическими или оптическими), позволяя
проводить анализ практически в любых средах: от природных пресных и соленых вод
до сточной воды на очистных сооружениях.
«Недостатками первых поколений
биорецепторов — биологических элементов биосенсоров (не только наших, это был
общемировой уровень) — были недолговечность, плохая воспроизводимость
характеристик и высокие требования к транспортировке, — поясняет Павел
Мельников. — Если с первыми двумя со временем удалось справиться, то требования
к перевозке в охлаждаемых контейнерах в сжатые сроки (подобно тому, как
перевозят человеческие органы для трансплантации) делали внедрение подобных
систем нерентабельным. В последнее время широкое распространение приобретает
технология сушки рецепторных элементов. Полученные пленки можно перевозить в
сухом виде при комнатной температуре в течение семи‒десяти дней, этого времени
вполне достаточно для доставки. В лаборатории перед анализом материал требуется
активировать (вывести из анабиоза) по определенной процедуре, после чего он
пригоден к измерениям в течение нескольких недель».
Разрабатываемое устройство для определения уровня БПК - комплект
«Эксперт-009-БПК» (экспресс) - является одной из разновидностей выпускаемого
компанией «Эконикс-Эксперт» анализатора растворенного кислорода Эксперт-009
Между измерениями биорецептор по-прежнему необходимо хранить в
холодильнике, что не является проблемой для среднестатистической лаборатории.
Это уже гораздо более привлекательный вариант в плане затрат на изготовление и
транспортировку, а значит, и конечной цены для потребителя, что делает
возможным широкое внедрение. Тем не менее эта технология сушки требует
масштабирования.
«Комплект “Эксперт-009-БПК” выпущен небольшой партией и эксплуатируется
в аккредитованной лаборатории ТулГУ, — рассказывает Павел Мельников. — Когда
коллегам удастся освоить новый способ подготовки к транспортировке, потенциальными
покупателями могут быть аккредитованные лаборатории анализа природных и сточных
вод, а также экологического мониторинга, которые в настоящее время пользуются
классической методикой БПК5. Сокращение времени анализа с пяти суток до 30‒60
минут — значимая экономия времени, которое может быть критически важным для
принятия решений».